Dag 2:PCR samt elektrofores

Dag 2 gjordes först i ordningen en pcr.
Pcr görs för att amplifiera den klonade genen.
För att sedan kontrollera vårt dna görs en gelelektrofores som innebär att man separerar nukleinsyrorna.
Vi fyllde våra 6 brunnar med våra olika lösningar i denna ordning:pcr-prov,markör IX,plasmid,markör  III,positiv kontroll,negativ kontroll.Trots bra fyllning av brunnarna hände något på vägen,vilket varken vi eller lärarna kunnat reda ut.Det fanns inte ett spår av färg eller vandring i gelen.Resultatet fotades under uv-ljus.Man kan se spår av att en vandring av nukleinsyrorna har påbörjats men sedan har alltså något inträffat.Första fotot nedan är vårat resultat.

Fotot nedan är ett resultat på en lyckad gelelektrofores

 

Brunn 1:negativ kontroll

Brunn 4:Positiv kontroll 

Brunn 5:markör  III 

Brunn 6:  plasmid

Brunn 7:markör  IX  

Brunn 8:PCR prov 

 

PCR är inte helt perfekt då smear kan urskönjas,detta kan bero på kontaminering eller inte helt optimalt med primrarna. Dock visar resultatet en utmärkt plasmidprep och påvisningpå att LL37 genen finns i provet.

 

1.Blev resultatet bra eller dåligt?

Med tanke på att nåt hände och alla våra prover "försvann" mer eller mindre så kan jag ju inte påstå att resultatet blev särskilt bra.Varför detta skedde vet man som sagt inte orsaken till.

Labbdag 1.Rening av rekombinant plasmid

Labbdag 1.Rening av rekombinant plasmid

På labbdag 1 gjordes en rening av rekombinant plasmid.från en bakteriesuspension. Detta gjordes genom ett flertal steg där buffertar som P1(innehållande RNase A), P2,N3,PB,PE och EB tillsattes och centrifugerades(dock var för sig). Stegen gjordes för att kunna utvinna plasmid DNA samt få bort RNA,kromosomalt DNA,celldebris och proteiner.

Därefter gjordes en renhet-och koncentrationsbestämning genom att mäta absorbansen i en spektrofotometer. Mängden UV-strålning som absorberas i lösningnen är direkt proportionell till mängden DNA i lösningen. Absorbansen mättes vid 260 nm samt 280 nm. För rent plasmid-DNA bör kvoten ligga på (A260/A280) 1,8 till 1,9(dock är en kvot mellan 1,6 till 2,0 helt ok.)
Vid 260nm uppnådes en absorbans på 0,058 och vid 280nm 0,032 (0,058/0,032) vilket ger oss en kvot på 1,81.
Även om kvoten är bra KAN det finnas andra nukleinsyror,ex kromosomalt DNA

260nm=50μg/ml dsDNA

Koncentrationen beräknades:
50x0,058=2,9μg/ml=0,0029μg/μl
0,0029x100(eftersom utspätt 100x)=0,29μg/μl
Konc för plasmid DNA=0,29μg/μl

1.Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Svar: Förhoppningsvis har vi fått bort RNA,kromosomalt DNA,proteiner och celldebris

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Svar: Kvoten vi fick på 1,81 är bra och kan vara en indikation på att endast ren plasmid återstår,dock finns det andra nukleinsyror och proteiner som kan absorberas vid samma våglängd så det kan inte fastställas till 100%.

3. Är det något du funderar på till nästa laboration?
Svar:Nej