Labbdag 1.Rening av rekombinant plasmid
På labbdag 1 gjordes en rening av rekombinant plasmid.från en bakteriesuspension. Detta gjordes genom ett flertal steg där buffertar som P1(innehållande RNase A), P2,N3,PB,PE och EB tillsattes och centrifugerades(dock var för sig). Stegen gjordes för att kunna utvinna plasmid DNA samt få bort RNA,kromosomalt DNA,celldebris och proteiner.Därefter gjordes en renhet-och koncentrationsbestämning genom att mäta absorbansen i en spektrofotometer. Mängden UV-strålning som absorberas i lösningnen är direkt proportionell till mängden DNA i lösningen. Absorbansen mättes vid 260 nm samt 280 nm. För rent plasmid-DNA bör kvoten ligga på (A260/A280) 1,8 till 1,9(dock är en kvot mellan 1,6 till 2,0 helt ok.)
Vid 260nm uppnådes en absorbans på 0,058 och vid 280nm 0,032 (0,058/0,032) vilket ger oss en kvot på 1,81.
Även om kvoten är bra KAN det finnas andra nukleinsyror,ex kromosomalt DNA
260nm=50μg/ml dsDNA
Koncentrationen beräknades:
50x0,058=2,9μg/ml=0,0029μg/μl
0,0029x100(eftersom utspätt 100x)=0,29μg/μl
Konc för plasmid DNA=0,29μg/μl
1.Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Svar: Förhoppningsvis har vi fått bort RNA,kromosomalt DNA,proteiner och celldebris
2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?
Svar: Kvoten vi fick på 1,81 är bra och kan vara en indikation på att endast ren plasmid återstår,dock finns det andra nukleinsyror och proteiner som kan absorberas vid samma våglängd så det kan inte fastställas till 100%.
3. Är det något du funderar på till nästa laboration?
Svar:Nej
Eftersom man prompt måste kommentera så får jag väl säga att det som man kan sakna är en förklaring till hur själva reningen går till. Du nämner t.ex. att RNas är med i den första bufferten, man skulle kanske kunna utveckla varför RNas behövs även fast det inte egentligen är en del av hänvisningarna för bloggen ;)
SvaraRaderaHej! Jag tycker att du svarat på uppgifterna ordentligt, men det hade varit trevligt med en lite mer utförlig förklaring till vad de olika buffertarna användes till och vad som hände med proteinerna/RNA: t/kromosomala DNA: t när buffertarna tillsattes. Vet inte riktigt hur jag ska formulera det här; men hur kan du veta redan innan du gör kontrollerna på reningen att reningen bör ha fungerat:)?
SvaraRadera